高速冷凍離心機提取植物蛋白質方法

2019-09-26 17:01:53 111

  高速冷凍離心機提取植物蛋白質方法

  一、植物組織蛋白質提取方法

  1、根據樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據材料不同適當加入),準備提取液放在冰上。

  2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨後加入提取液中在冰上靜置(3-4小時)。

  3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

  4、提取上清液,樣品製備完成。

  蛋白質提取液:300ml

  1、1Mtris-HCl(PH8)45ml

  2、甘油(Glycerol)75ml

  3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

  這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!

  二、植物組織蛋白質提取方法

  氯醋酸—丙酮沉澱法

  1、在液氮中研磨葉片

  2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然後離心(4℃8000rpm以上1小時)棄上清。

  3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻後離心(4℃8000rpm以上1小時),然後真空幹燥沉澱,備用。

  4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鍾,使蛋白充分溶於裂解液中,然後離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉澱為標準),可臨時保存在4℃待用。

  5、用Brandford法定量蛋白,然後可分裝放入-80℃備用。

  藥品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶於3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

  這種方法針對雙向電泳,雜質少,離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用,隻是電泳的條帶會減少!

  三、組織:腸黏膜

  目的:WESTERNBLOT檢測凋亡相關蛋白的表達

  應用TRIPURE提取蛋白質步驟:

  含蛋白質上清液中加入異丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

  倒轉混勻,置室溫10min

  離心:12000g,10min,4度,棄上清

  加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)

  振蕩,置室溫20min

  離心:7500g,5min,4度,棄上清

  重複0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次

  沉澱中加入100%乙醇2ml

  充分振蕩混勻,置室溫20min

  離心:7500g,5min,4度,棄上清吹幹沉澱

  1%SDS溶解沉澱

  離心:10000g,10min,4度

  取上清-20度保存(或可直接用於WESTERNBLOT)

  存在的問題:加入1%SDS後沉澱不溶解,還是很大的一塊,4度離心後又多了白色沉定,SDS結晶?測濃度,含量才1mg/ml左右。

  解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2XBUFFER,然後煮5-10分鍾,效果很好的。

  四、植物材料:水稻苗,葉鞘,根

  1、200毫克樣品置於冰上磨碎

  2、加lysisbuffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清

  3、重複離心5min

  lysisbuffer:ureanp-40ampholine2-mepvp-40

  五、蛋白質樣品製備

  秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進行。

  100mg材料剪碎後加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配製,含10mM即0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20℃沉澱1小時,4℃,15000r/min離心15min,棄上清,沉澱複溶於1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇),再於-20℃沉澱1小時,同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉澱低溫冷凍真空抽幹。

  按每mg幹粉加入20μl(可調)UKS液[9.5M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc,pH3.5-10),6%TritonX-100],37℃溫育30min,期間攪動幾次,28度(溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000r/min離心15min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳。或者-70度保存

  六、植物根中蛋白質的抽取

  (1)sample,液氮研磨

  (2)裝1.5mlcentrifuge用tube

  (3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul

  (4)12000rpm,4度,10-15minite

  (5)取上層液,蛋白質就在裏麵


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